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    公开号:WO1988004663A1
    申请号:PCT/EP1987/000775
    申请日:1987-12-12
    公开日:1988-06-30
    发明作者:Carl Heinz Ross；Rudolf Machat；Werner HÄRING；Gustav Lettenbauer
    申请人:Boehringer Mannheim Gmbh；
    IPC主号:C07J19-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung von Herzglykosiden unter Verwendung unpolarer Adsorberharze.
    [0002] Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Aufarbeitung von Herzglykoside enthaltenden Mischungen, wie Rohextrakten, Produkten chemischer Abwandlungen und Kristallisationsstufen, sowie Mutterlaugen-
    [0003] Unter Herzglykosiden werden Verbindungen der allgemeinen Formeln I II oder III verstanden
    [0004] R-0-(D-0-)1_3-(Glucoserest-0-)1_2-H (I) ,
    [0005] R-Q- (OO-) 1 oder3-R' (II), bzw.
    [0006] R-0-(Glucoserest-0-)1_2-H . (III),
    [0007] worin jeweils
    [0008] R ein Aglykon, R* Wasserstoff, eine Methyl- oder Acetylgruppe und D einen Desoxyzuckerrest bedeuten (vgl. Ulimann, 3. Aufl., Band '8, S. 222 - 231) .
    [0009] Zur Isolierung der Herzglykoside, wie Digoxin, Metildigoxin, Strophantinen, anatosiden aus Mischungen wie sie z.B. bei Extraktionen der Pflanzenteile, chemischen Abwandlungen und Kristallisationsoperationen anfallen, sind meist aufwendige Verfahren nötig, wie mehrfache Gegenstromverteilung, Umlosungen un
    [0010] Umfällungen. (Vergl. zum Beispiel: Ulimann, a.a.O.).
    [0011] Diese Verfahren erfordern den Einsatz großer Mengen potentiell umweltgefährdender organischer Lösemittel wie Chloroform, Dichlormethan, Trichlorethylen. Die Handhabung dieser Lösemittel in großen Mengen führt zu einem großen technischen Aufwand zur 88/04663
    [0012] - 2 -
    [0013] Reinhaltung von Luft und Wasser. Die Verluste an wertvollen Glykosiden in nicht verwertbaren Mutterlaugen und Konzentraten sind hoch.
    [0014] Hier will die Erfindung Abhilfe schaffen. Die Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, löst die Aufgabe, Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von Herzglykosiden aus Mischungen wie Rohextrakten, Produkten chemischer Abwandlungen und Kristallisationsstufen, sowie aus Mutterlaugen bereitzustellen, die weitestgehend ohne die nach dem Stand der Technik erforderlichen potentiell umweltgefährdenden Lösemittel auskommen und zudem die Verluste an wertvollen Glykosiden verringern und damit die Ausbeuten steigern.
    [0015] Es wurde gefunden, daß die Anreicherung und Aufreinigung der Herzglykoside aus den oben näher bezeichneten Mischungen und Mutterlaugen durch Adsorption an unpolaren, großporigen Harzen aus wäßriger Lösung eventuell unter Zusatz von .mit Wasser mischbaren Lösemitteln und anschließende Desorption mit
    [0016] Wasser-Lösemittelgemischen oder reinen Lösemitteln bewerkstelligt werden kann. Überraschend ist dabei insbesondere, daß dabei gleichzeitig eine Trennung der Glykosidgemische in Einzelverbindungen oder Gruppen durch Variation der Zusammensetzung der Desorptionslδsung möglich ist.
    [0017] Die Isolierung von wertvollen Stoffen, wie den antibiotisch wirksamen Cephalosporinen, aus stark verdünnten Lösungen mit Hilfe polymerer unpolarer Harze ist seit langem bekannt. Die Problematik der Anreicherung und Isolierung von Herzglykosiden aus komplexen Herzglykosid-Gemischen und insbesondere die Gefährdung durch die dazu erforderlichen Lösemittel ist noch länger bekannt. Die vorliegende Erfindung befriedigt damit ein lange bestehendes Bedürfnis.
    [0018] Die zur erfindungsgemäßen Anreicherung und Isolierung erforderliche Adsorption und Desorption kann kontinuierlich oder diskontinuierlich (Batch-Verfahren) durchgeführt werden. Bevorzugt wird dieser Prozeß aber auf einer Säule unter leichtem Druck von 1 bis 10 bar bei
    [0019] T Teemmppeerraattuurreenn 'von 20 bis 50°C, bevorzugt Raumtemperatur durchgeführt.
    [0020] Dazu gibt man auf eine mit einem geeigneten Harz gefüllte Säule die wäßrige Lösung eines Rohextraktes oder verunreinigten Glykosidgemisches eventuell unter Zusatz von 1 - 80 % niederen Alkoholen, vorzugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, niederen Ketonen, vorzugsweise Aceton, nachdem durch Behandlung des Ron-Extraktes mit einem unpolaren Lösemittel, vorzugsweise Hexan, Toluol, Isohexan oder Petrolether, die fettartigen Bestandteile entfernt worden sind.
    [0021] Alle stark polaren Stoffe, wie Zucker, werden durch Spülen mit Wasser aus der beladenen Säule entfernt. Durch Zusatz von mit Wasser mischbaren Lösemitteln, vorzugsweise Alkoholen, niederen Ketonen oder cyclischen Ethern, durch Zugabe von Salzen und Einstellung eines bestimmten pH-Wertes wird die Elutionslösung so variiert, daß einzelne Herzglykoside oder Gruppen von Glykosiden aus dem Harz desorbiert werden. Alle Lösemittel können so gewählt werden, daß sie möglichst umweltverträglich sind. Die für die Vorreinigung erforderlichen großen Mengen chlorierter Kohlenwasserstoffe können dadurch umgangen werden.
    [0022] Als Adsorbentien eignen sich unpolare Adsorberharze mit großer Oberfläche. Insbesondere großporige nichtionische Harze wie vorzugsweise vernetzte Styrolpolymere, Acrylesterpolymerisate und/oder Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate. Harze, die chemisch modifiziert, insbesondere halogeniert oder physikalisch klassiert, wie gesiebt, in der Korngröße, Oberfläche vereinheitlicht, sein können.
    [0023] Solche Harze sind z.B. unter den Bezeichnungen Amberlite XAD (Warenzeichen: Rohm and Haas Co.), Diaion HP (Warenzeichen: Mitsubishi Chemical Industries Limited) oder Sepabeads SP (Warenzeichen: Mitsubishi Chemical Industries Limited) jeweils in 4 -
    [0024] Serien mit verschiedenen Oberflächen- und damit Adsorptionseigenschaften erhältlich. Zum Beispiel:
    [0025]
    [0026] *) Chemical Abstracts Service Registernummer - 5
    [0027] Innerhalb dieser Serien wird noch nach Korngröße differenziert.
    [0028]
    [0029] Die letztgenannten 4 Harze haben sich als besonders geeignet herausgestellt. Insbesondere aber DiaionR HP 20 SS. und KP 21 SS.
    [0030] Die unterschiedlichen Adsorptionsfähigkeiten der verschiedenen Harztypen lassen sich zu besonders zweckmäßigen Trennverfahren kombinieren. 88/04663 '
    [0031] - 6
    [0032] Weitere Pflanzeninhaltsstoffe, wie Chlorophyll, desorbiert man durch Aufgabe von organischen Lösemitteln, vorzugsweise Alkoholen, Ketonen oder Estern auf die Säule. Nach Einengen der so erhaltenen Lösungen werden reine Stoffe nach Umlösen und Umfallen eventuell unter Zusatz von Hilfsstoffen, vorzugsweise Aktivkohle, Aluminiumoxid oder Bleicherden (wie Floridin) erhalten. Alternativ zum energieaufwendigen Einengen kann die Isolierung aus wäßrigen Lösungen auch durch Aufziehen (Adsorption) auf ein polymeres Harz und Desorption mit einem organischen Lösemittel erfolgen.
    [0033] Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
    [0034] Beispiel 1;
    [0035] Digoxin
    [0036] Auf eine Säule, gefüllt mit 410 ml DiaionR HP 20 SS (Hersteller: Mitsubishi, Japan), werden 3,6 1 wäßrig/methanolischer Rohextrakt von Digitalis lanata nach vorhergegangener Fermentation, Verseifung und Entfettung aufgezogen. Der Extrakt enthält 117 g Trockensubstanz mit einem Digoxingehalt von 1,95 g. Auf der Säule werden nach Spülen mit 4,9 1 Wasser 12,2 g Trockensubstanz mit 1,95 g Digoxin festgehalten.
    [0037] Nach Elution bei 3 bar mit wäßrigem Isopropanol erhält man Fraktionen die stark an Digoxin angereichert sind. 6,3 1 15 I Isopropanol-Lösung werden zusammengeführt und bis auf 100 ml eingeengt. Die auskristallisierte Rohdigoxinfraktion (4,9 g), wird in 50 ml Methanol/Chloroform 1:1 heiß gelöst, mit Aktivkohle behandelt und über 7,5 g Aluminiumoxid filtriert. Man wäscht mit 80 ml Methanol/Chloroform 1:1, engt die gesammelten Filtrate auf 50 ml ein und fällt mit 65 ml Diisopropylether. Man isoliert 1,4 g Digoxin. Beispiel 2:
    [0038] Lanatosid C
    [0039] 20 g trockener Extrakt der genuinen Glykoside aus Digitalis lanata (Gehalt: Lanatosid C 12 $, ca. 1 % Digoxin, ca. 1,5 $<_ -Acetyl- digoxin) werden in 150 ml Wasser und 45 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wird mit 1,4 1/h Fließgeschwindigkeit auf eine Säule mit 410 ml DiaionR HP 20 SS gebracht. Mit einem Druck von 4-5 bar wird anschließend mit Wasser, dem steigende Mengen Methanol zugesetzt werden, eluiert. Ab 50 % Methanol-Anteil können die Glykoside in der Reihenfolge Lanatosid C, Digoxin, <x-Acetyldigoxin, ß-Acetyldigoxin, Lanatosid A im Eluat nachgewiesen werden. Die Fraktion von 6 1 mit 55 % Methanol wird vollständig eingeengt (2,53 g mit 60-70 I Lanatosid C und 3 % Digoxin) und aus Ethanol unter Zusatz von Aktivkohle umkristallisiert. Man erhält 1,0 g reines Lanatosid C. Der Mutterlaugenrückstand und Mischfraktionen werden erneut über die
    [0040] Säule gereinigt und getrennt.
    [0041] Beispiel 3:
    [0042] K-Strophantin
    [0043] 20 g Trockensubstanz des mit Hexan entfetteten Ethanolextraktes von Strophanthus kombe-Samen werden in 100 ml Wasser gelöst und auf eine Säule, gefüllt mit 410 ml DiaionR HP 20 SS gepumpt.
    [0044] Mit 4,2 1 Wasser werden bei 4-5 bar und einer Fließgeschwindigkeit von 1,4 1/h alle Nichtglykoside ausgewaschen (8,3 Trockensubstanz).
    [0045] Nach Zusatz von 45 % Methanol zur Elutionsflüssigkeit erhält man 7,8 1 Flüssigkeit mit den Glykosiden. Es wird eingeengt (6,9 g), in Ethanol gelöst, mit Aktivkohle behandelt und mit Diisopropylether gefällt. Es werden 6,06 g reines Glykosid-Gemisch (75 %y-K-Stro- phantin, 12 , 5 % ß^K-Strophantin, 9 , 5 % ß2-K-Strophant in) erhalten . Das Gemisch entspricht ohne größere Weiterbearbeitung bereits den Anforderungen der Pharmacopoeen.
    [0046] Beispiel 4 :
    [0047] y-K-Strophantin und ß^-K-Strophantin
    [0048] 20 g Trockensubstanz wie aus Beispiel 3 werden auf 410 ml DiaionR HP 20 SS aufgebracht. Man eluiert die Säule mit Wasser mit einem bis auf 30 % steigenden Methanolgehalt. Die so erhaltenen Fraktionen (Trockensubstanz: 10,1 g) enthalten keine Glykoside des K-Strophantins. Die Fraktion (2,8 1) mit 40 % Methanol ergibt nach Einengen 5,3 g ικ-K-Strophantin. Nach Erhöhen des Methanolanteiles auf 45 % wird eine Mischfraktion (7,5 1) (3,0 g nach Einengen) von tr-, ß.. - und ß2~K-Strophantin erhalten, 2,1 1 Eluat mit 50 prozentigem Methanol enthalten 0,61 g (Trockensubstanz) ßo-K-Strophantin.
    [0049] Beispiel 5:
    [0050] g-Strophantin
    [0051] Mutterlauge von Ethanol-Extrakten von Strophantus gratus-Samen die nicht mehr zur Kristallisation zu bringen ist, aber noch Glykosid enthält, wird zur Trockene gebracht.
    [0052] 20 g Trockensubstanz werden in 100 ml lOprozentigem Methanol gelöst und mit 0,9 1/h Fließgeschwindigkeit auf eine Säule mit 410 ml DiaionR HP 20 SS gepumpt. Man eluiert mit 4 1 lOprozentigem Methanol alle Zuckerbestandteile und polare Nichtherzglykoside.
    [0053] Nach Erhöhen des Methanolgehaltes auf 20 I spült man mit 3 1 bei 3-4 bar und einer Flußrate von 1,4 1/h g-Strophantin (3,69 g) aus der Säule. Nach Einengen wird aus Wasser unter Zusatz von Aktivkohle umkristallisiert. Man erhält 2,12 g reines g-Strophantin. - 9 -
    [0054] Beispiel 6 :
    [0055] Digoxin (vgl. Zeichnung)
    [0056] 60 g Trockenextrakt (enthält ca. 1.0 g Digoxin) - hergestellt durch wäßrig/methanolische Extraktion von Digitalis lanata, Fermentation, Verseifung, Entfettung und Trocknen - werden in 120 ml Methanol und 480 ml Wasser gelöst, mit konzentrierter Ammoniaklösung auf pH 7.5 eingestellt und mittels der Pumpe (3) auf die Säule (1), gefüllt mit 410 ml DiaionR HP 2MG, gepumpt. Ventil (6) ist auf Ablauf (8) gestellt. Nach Spülen mit 2,2 1 Wasser und 3,8 1 Methanol/Wasser (v./v. 25:75) werden im Ablauf nach Einengen 54.8 g Trockensubstanz erhalten, die keine Herzglykoside enthalten. Die Ventile (6) und (5) werden nun so gestellt, daß der Ablauf von Säule (1) auf Säule (2), gefüllt mit 50 ml DiaionR HP 20 SS, führt. 5 1 Elutionslösung Methanol/Wasser (v./v. 45:55) enthalten im.Ablauf (7) kein Digoxin. Fraktionen mit Nebenglykosiden können getrennt aufgearbeitet werden. Ventile (4) und (5) werden nun so gestellt, daß die Elutionslösung direkt auf Säule (2) gegeben wird. Nach 1 1 eines Methanol/Wasser-Gemisches (v./v. 50:50), die 0,9 g Trockensubstanz mit 27 % Digoxin enthalten und in den Trennprozeß zurückgeführt werden, wird mit 1.5 1 eines Methanol/Wasser-Gemischs (v./v. 55:45) eluiert. Diese Fraktion wird eingeengt, aus Methanol/Wasser umgelöst, in Methanol/Chloroform gelöst, mit Aktivkohle und Aluminiumoxid behandelt und mit Diisopropylether gefällt. Man isoliert 684 mg Digoxin hoher Reinheit.
    [0057] Das Verfahren des Beispiels 6 wird anhand der Zeichnung weiter erläutert. Sie zeigt lediglich eine mögliche Ausgestaltung des Flußdiagrammes. 88/04663
    [0058] - 10 -
    [0059] Darin bedeuten die Bezugszeichen
    [0060] (1) Säule gefüllt mit 410 ml DiaionR HP 2MG
    [0061] (2) Säule gefüllt mit 50 ml Diaion HP 20 SS
    [0062] (3) Pumpe
    [0063] (4) 3-Wege-Ventil
    [0064] (5) 3-Wege-Ventil
    [0065] (6) 3-Wege-Ventil
    [0066] (7) Ablauf-Ventil
    [0067] (8) Ablauf-Ventil
    [0068] Beispiel 7;
    [0069] Metildic.o_.in
    [0070] 10 g des aus der Methylierung von Digoxin mit Dimethylsulfat erhaltenen Gemisches aus hauptsächlich ß-Metildigoxin (60 - 65 %) J -Metildigoxin (ca. 7,5 %) , Digoxin (15 - 20 %) und Dimethylethern des Digoxins (ca. 8 %) werden in 85 ml Ethanol abs. und 12 ml Wasser warm gelöst und klar filtriert. Diese Lösung wird auf eine Säule mit 410 ml HP 20 SS, die zuvor mit Ethanol 30 % gespult wurde, gepumpt. Anschließend wird mit Wasser mit steigendem Ethanolgehalt unter einem Druck von 4 bar und einem Durchfluß von ca. 1 1/Stunde gespült.
    [0071] 4,75 1 Eluat mit 40 % Ethanol enthalten 3,91 g Feststoff. Das Gemisch enthält alles nicht umgesetzte Digoxin, t -Metildigoxin und ß-Metildigoxin und kann erneut auf der Säule getrennt werden. Die folgende Fraktion von 5 1 enthält 4,73 g schwach verunreinigtes ß-Metildigoxin. Wird der Ethanolgehalt erhöht, werden Diether und höhere Ether des Digoxins eluiert. Die Hauptfraktion mit Metildigoxin wird aus Methanol/Wasser umgefällt, mit Chloroform aufgekocht und mit Aceton ausgerührt.
    [0072] Man erhält 3,65 g ß-Metildigoxin von Standardqualität. - 11 -
    [0073] Beispiel 8
    [0074] Digoxin
    [0075] 120 g Trockenextrakt mit einem Digoxin-Gehalt von ca. 1,9 g (vgl. Beispiel 6) werden in 960 ml Wasser, 240 ml Ethanol und 5 ml konzentrierter Ammoniaklösung bei Raumtemperatur gelöst und klar filtriert. Die Lösung wird auf eine Säule mit 410 ml Diaion R HP 20 gepumpt.
    [0076] (Druck 2 bar, Flußrate 1 - 1,2 1/Stunde) .
    [0077] Säulen ablauf und 1,8 1 Spülwasser enthalten 87,2 g Trockensubstanz frei von Herzglykosiden.
    [0078] Es folgen Elutionen mit 4,4 1 Ethanol 20 % und 2,4 1 Ethanol 27,5 %. Letztere enthält geringe Anteile an Digoxin (< 2,5 %) und wird erneut eingesetzt.
    [0079] 5,0 1 Eluat Ethanol 40 % enthalten die Hauptmenge an Digoxin (8,3 Trockensubstanz, ca. 20 % Digoxin). Nach einer Zwischenfraktion (1,2 1) Entahlol 43 %, die zurückgeführt wird, wird mit reinem Ethanol die Säule für den nächsten Zyklus gespült. In den ersten 2 1 des Spülethanols findet man die Hauptmenge des Digitoxins (Trockenrückstnad 3,5 g, 10 % Digitoxin) , das daraus gewonnen werden kann. Die Digoxin-Fraktion wird durch Destillation auf 1,42 1 konzentriert und auf eine Säule mit 410 ml HP 20 SS gepumpt (Druck 4 - 10 bar, Fließgeschwindigkeit 1,2 1/Stunde) . Der Säulenablauf von 1,5 1 und die Fraktionen mit Ethanol 20 % (1,5 1), Ethanol 24,5 % (4,6 1) und Ethanol 27 % (3,75 1) enthalten kein Digoxin. Nach einer Spülung mit Ethanol 33 % (0,5 1) zur Abtrennung von Digoxigenin-bis-digitoxosid wird der Ethanolgehalt auf 40 % gesteigert.
    [0080] Man sammelt 6 Fraktionen zu 0,39 1. Die Fraktionen 1,5 und 6 werden zur Elution der HP 20 Säule eingesetzt. In 3,72 g Trockensubstanz der Eluate 2,3 und 4 sind 1,86 g Digoxin enthalten. Zur Regenerierung wird die Säule mit reinem Ethanol gespült. Das rohe Digoxin wird in 50 ml Ethanol/Wasser 1 : 1 warm gelöst, auf 25 ml konzentriert, gekühlt und abgesaugt. Man erhält 1,85 g, die in Chloroform/Methanol 9 : 1 gelöst, mit Kieselgβl nd Aktivkohle behandelt und konzentriert werden. Das Kristallisat wird in Ethanol unter Zusatz von Ammoniak aufgekocht, heiß abgesaugt und getrocknet. Es werden 1,1 g Reindigoxin erhalten.
    [0081] Beispiel 9
    [0082] Digoxin, Gitoxin, Diqitoxin
    [0083] Man löst 50 g entfetteten Trockenextrakt von Digitalis lanata (wie in Beispiel 6) in 415 ml Wasser, 154 ml Methanol und 2 ml konzentrierte Ammoniaklösung. Die klar filtrierte Lösung wird auf eine Säule mit 470 ml Diaion R HP 21 SS gepumpt. Mit einem Druck von 4 bar und einer Flußrate von 1,0 1/Stunde wird anschließend fraktioniert eluiert.
    [0084] Säulenabläufe bis 55 % Methanol (1,59 1) enthalten in 43,4 g Trockensubstanz nicht identifizierte Zucker und Glykoside.
    [0085] Die letzten Fraktionen enthalten Digoxingenin-bis-digitoxosid stark angereichert und können auf dieses Glykosid aufgearbeitet werden.
    [0086] 2,5 1 Eluat mit 65 % Methanol-Anteil enthalten 1,12 g Trockensubstanz mit über 60 % Digoxin, die nach üblichen Reinigungsschritten 0,52 g reines Digoxin ergibt. In den Fraktionen mit 70 % Methanol (2,5 1) sind geringe Mengen Digoxin. Diese werden erneut auf die Säule gegeben.
    [0087] 1,5 1 Fraktion (80 % Methanol) enthalten stark angereichert das Glykosid Gitoxin und können auf dieses aufgearbeitet werden. 0,81 g der Fraktion mit reinem Methanol (0,9 1) enthalten 80 mg Digitoxin, das aus dieser Fraktion isoliert werden kann.
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung von Herzglykosiden durch Flüssigkeitsverteilungschromatographie dadurch gekennzeichnet, daß Adsorption und Desorption an unpolaren, nichtionischen, großporigen Harzen auf Basis von vernetzten Styrolpolymeren, Acrylesterpolymerisaten und/oder Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisäten erfolgen.
    2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Harze
    2 eine spezifische Oberfläche von 100 - 1000 m /g Harz haben.
    3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2 d.g., daß als Elutionsmittel Mischungen aus Wasser und niederen Alkoholen oder Ketonen im Verhältnis 99:1 bis 20:80 eingesetzt werden.
    4. Verwendung von unpolaren, nichtionischen, großporigen Harzen auf Basis von vernetzten Styrolpolymeren Acrylesterpolymerisaten und/oder Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisaten zur Anreicherung und/oder Isolierung von Herzglykosiden.
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
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    1988-12-14| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1987907962 Country of ref document: EP |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DEP3643760.3||1986-12-20||
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